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CRISPR: cómo las bacterias nos enseñan a editar los genes

Por Lluís Montoliu (CSIC)*

Frecuentemente pensamos en las bacterias como fuente de problemas. Efectivamente, son las causantes de enfermedades infecciosas tan graves como la tuberculosis, el cólera o la peste, pero también son las que nos proporcionan yogures y otros derivados lácteos. Además, las bacterias llevan miles de millones de años sobre la Tierra, muchísimos más que nosotros. Durante todo este tiempo han desarrollado un sistema de defensa muy eficaz que les permite zafarse de la infección por virus.

El sistema inmune de las bacterias fue descubierto por Francisco Juan Martínez Mojica, microbiólogo de la Universidad de Alicante, que lleva más de 25 años investigando sobre este tema. ¿Qué hace que este mecanismo de defensa sea tan especial? Pues, entre otras cosas, que se transmite genéticamente, de unas bacterias a sus hijas o descendientes. Por ejemplo, cuando nosotros nos vacunamos contra el virus del sarampión adquirimos unas defensas que evitan que desarrollemos esta enfermedad. Ahora bien, nuestros hijos no heredan esta defensa. Si queremos que ellos estén protegidos contra el sarampión, también tenemos que vacunarlos (algo sobre lo que nadie debería albergar hoy en día ninguna duda, por cierto). Las bacterias son más inteligentes que nosotros. Una vez aprenden a defenderse de un virus son capaces de transmitir esta defensa a sus hijas, y éstas a sus nietas, etc., perpetuando esta defensa. Este descubrimiento básico de Mojica, realizado en 2003, sirvió para que otros investigadores se dieran cuenta de que el mecanismo por el cual las bacterias se defienden de los virus también puede usarse, sorprendentemente, para editar los genes con una precisión nunca antes vista.

En 2012 varios científicos, entre ellos las investigadoras Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier, describieron este sistema de edición basándose en los trabajos de Mojica. El sistema está formado por una proteína, denominada Cas, que actúa como una tijera molecular capaz de cortar el ADN de forma muy precisa dirigida por una guía, una pequeña molécula de ARN que le dice a la tijera Cas dónde tiene que cortar. Este sistema se denomina CRISPR (pronúnciese “crisper”), acrónimo en inglés que describe las características de estas secuencias genéticas que dirigen el corte de la tijera molecular. Éste fue el nombre, hoy en boca de investigadores de todo el mundo, acuñado también por Mojica en 2001.

El mecanismo por el cual las bacterias se defienden de los virus también puede usarse para editar los genes. / geneticliteracyproject.org

¿Qué podemos hacer con las herramientas CRISPR? Igual que cuando nos equivocamos al escribir un texto en el ordenador y podemos volver atrás y corregir, eliminar o sustituir la palabra o letras erróneas, con las herramientas CRISPR podemos editar los genes. Podemos añadir letras si faltan, eliminar letras si sobran, sustituirlas o corregirlas por otras. En definitiva, podemos modificar los genes a voluntad. Esto ha provocado una verdadera revolución en biología, biomedicina y biotecnología.

Ahora podemos desarrollar modelos celulares y animales más adecuados para el estudio de las enfermedades. Por ejemplo, tras diagnosticar a un paciente afectado por alguna de las miles de enfermedades raras de base genética que existen, y detectar el gen y la mutación causantes de esa enfermedad, podemos replicar exactamente esa misma mutación en ratones. A estos ratones que reproducen la misma alteración genética de un paciente los llamamos ‘ratones avatar’ para ilustrar la conexión existente entre ellos. Gracias a ellos podremos validar la seguridad y eficacia de nuevos tratamientos de una forma más efectiva, ya que son portadores del mismo error genético. Si somos capaces de introducir una mutación en ratones, también deberíamos poder usar las mismas herramientas CRISPR para revertir errores genéticos que afectan a los millones de personas con alguna enfermedad rara. No estamos todavía ahí, pero sí en el buen camino.

Ratones avatar modificados genéticamente con CRISPR. / Davide Seruggia

Los resultados preliminares de tratamientos genéticos basados en CRISPR probados en animales son muy esperanzadores, pero todavía no están listos para su aplicación efectiva en pacientes. ¿Por qué no podemos usar las herramientas CRISPR en el hospital? En primer lugar, la precisión que tienen las herramientas de edición genética CRISPR no es absoluta. En determinadas ocasiones pueden cortar en secuencias genéticas muy parecidas, causando alteraciones no deseadas en genes similares que no deberíamos modificar, y cuyos cambios pueden causar problemas mayores de los que queremos solucionar. Esta es una limitación que puede reducirse al mínimo si se diseñan cada vez mejores guías y se seleccionan tijeras moleculares con mayor precisión.

Pero lo más preocupante es la segunda de las limitaciones de las herramientas CRISPR. Toda la precisión que tienen para cortar el genoma en el gen y la secuencia correctas, no la tienen los mecanismos de reparación que entran en juego inmediatamente tras el corte, restaurando la continuidad del cromosoma. Estos sistemas de reparación, que tenemos en nuestras células, progresan de forma un tanto azarosa, añadiendo y quitando letras hasta conseguir enganchar los dos fragmentos del cromosoma cortado. Si bien es cierto que podemos inducir la reparación con secuencias genéticas molde que sirvan como patrón para la reparación, también sucede que no siempre las células usarán el molde y, por ello, al reparar el corte, generarán una nueva modificación genética no deseada. Tenemos que seguir investigando estos mecanismos de reparación, para poder controlarlos y hacerlos más precisos y seguros. Solamente entonces podremos recomendar, siempre con prudencia, el uso de las herramientas CRISPR en el tratamiento de enfermedades de base genética en personas.

Tras proponerlas como sistemas de edición genética en 2012, las herramientas CRISPR fueron usadas por vez primera en 2013. Hoy, apenas cuatro años más tarde, ya estamos pensando en maneras de optimizar su uso en terapias para enfermedades, para hacerlas más seguras y efectivas. Cuando estudiaba los microorganismos que habitan las salinas de Santa Pola, Mojica no podía imaginar el camino futuro que iban a tomar sus investigaciones de biología básica. Tratando de entender como esas bacterias se defendían de los virus que las acechaban, llegó hasta un hallazgo revolucionario. Ahí está la belleza y el poder de la ciencia. Un descubrimiento microbiológico, en apariencia menor, que pasa a ser la mayor revolución tecnológica en biología. Así pues, debemos de estar agradecidos a las bacterias, por mostrarnos nuevas formas de luchar contra las enfermedades. Y a Francisco Mojica, por haber descubierto este proceso de la naturaleza y habérnoslo contado, por haber descrito el sistema CRISPR que tantas aplicaciones biomédicas está produciendo.

Vídeo en el que la proteína Cas9 corta una molécula de ADN en tiempo real por microscopía de fuerza atómica. Imágenes de la Universidad de Tokio publicadas en este artículo.

 

* Lluís Montoliu es investigador del Centro Nacional de Biotecnología (CNB) del CSIC.

 

‘Nanobásculas’ para pesar virus y bacterias en la detección de enfermedades

Por Eduardo Gil Santos, Alberto Martín Pérez y Marina López Yubero  (CSIC)*

Cada virus y bacteria tiene una masa diferente. El simple hecho de poder pesarlos nos permitiría identificarlos y distinguirlos y, con ello, detectar de forma altamente precoz las enfermedades que provocan. Los recientes avances en nanotecnología han permitido la creación de unos nuevos dispositivos, los sensores nanomecánicos, que actúan como básculas a escala nanométrica, permitiendo detectar estos objetos con una precisión mucho mayor que los métodos convencionales de diagnóstico de estas enfermedades.

Cuerdas de ukelele

Los nanosensores vibran como las cuerdas de una guitarra para detectar virus y bacterias.

La detección de estas partículas mediante sensores nanomecánicos se obtiene estudiando los cambios en su vibración. Estos sensores vibran igual que las cuerdas de una guitarra: cuando pulsamos una cuerda de una guitarra, esta vibrará y las ondas se transmitirán por el aire, lo que percibiremos como sonido. Además, si unimos un objeto a la cuerda, esta pesará más y, en consecuencia, su movimiento será más lento, lo que dará lugar a un sonido más grave. Esta diferencia en el tono del sonido se puede relacionar directamente con la masa del objeto unido. De la misma manera, los sensores nanomecánicos vibrarán más lentamente cuando se une a ellos una partícula (virus o bacteria). Esto se comprueba fácilmente adhiriendo un pequeño imán a un diapasón. Sin embargo, en estos sensores las vibraciones no son perceptibles por el oído y se necesitan métodos ópticos muy avanzados (similares a los utilizados en la detección de ondas gravitacionales, pero a escala nanométrica) para detectar estos cambios en la vibración del sensor.

Bacteria en nanosensor

Imagen de microscopía electrónica de barrido de una bacteria E. coli sobre un sensor nanomecánico con forma de micropalanca. El peso de esta bacteria es de 300 femtogramos (0,0000000000003 gramos, diez mil millones de veces menos que una hormiga).

Estos dispositivos también permiten medir otra propiedad muy interesante de las partículas depositadas: la rigidez. Conocer la rigidez de las partículas biológicas (virus, bacterias o células) puede ser de gran utilidad, ya que, por una parte, la rigidez junto con la masa permite una identificación todavía más precisa de los distintos virus o bacterias. Asimismo, podría permitir diferenciar entre células cancerígenas y sanas, ya que se ha descubierto que aunque ambas tienen una masa similar (lo que no permite distinguirlas a través de su masa), muestran una rigidez distinta: las células cancerígenas son menos rígidas que las células sanas. Por último, medir la rigidez de los virus hace posible distinguir su estado de maduración y conocer su capacidad infecciosa.

El grupo de Bionanomecánica del Instituto de Micro y Nanotecnología del CSIC desarrolla este tipo de dispositivos desde hace más de diez años. En la actualidad, este grupo lidera una serie de proyectos financiados por la Unión Europea (ViruScan, LiquidMass, Nombis) que contribuirán a la implantación definitiva de estas tecnologías a nivel clínico. En tan solo cinco años, estos sensores se probarán en países empobrecidos con gran riesgo de epidemias para la detección de los virus que producen fiebres hemorrágicas.

Al mismo tiempo, el equipo trabaja en el desarrollo de nuevas tecnologías para la comprensión y detección precoz de muchas otras enfermedades (distintos tipos de cáncer, Alzhéimer, etc.). En un futuro no muy lejano, este tipo de sensores estarán implantados directamente en el interior de nuestro cuerpo, preparados para detectar cualquier infección en el mismo momento de contraerla, lo que permitirá actuar contra ella de manera mucho más eficaz.

 

* Eduardo Gil Santos, Alberto Martín Pérez y Marina López Yubero son personal investigador del CSIC en el grupo de Bionanomecánica del Instituto de Micro y Nanotecnología.

¿Cuál es el origen del virus del SIDA?

B. PachecoPor Beatriz Pacheco (CSIC)*

¿Cómo y cuándo surgió el virus del SIDA en humanos? Existen múltiples teorías acerca de su origen. Algunas llegan a afirmar que el VIH no existe y que el SIDA se debe a un déficit de vitaminas; otras se apuntan a tesis conspirativas y sostienen que el virus fue generado en un laboratorio por científicos estadounidenses, y las hay que incluso defienden que la epidemia se debe a un “castigo divino”. Obviamente, estas explicaciones carecen de fundamento científico. Sin embargo, la ciencia sí ha podido demostrar que el VIH procede de la transmisión a los humanos de unos virus similares que infectan con una alta prevalencia ciertas especies de monos africanos.

Pero ¿cuándo surgió el VIH? Aunque los primeros casos de SIDA se describieron en EEUU en 1981, diversos estudios filogenéticos han situado las primeras infecciones causantes de la pandemia actual en torno a 1920 en Kinsasa, capital de la República Democrática del Congo. La expansión demográfica de principios del siglo XX, junto con el desarrollo industrial y el aumento del comercio sexual, habrían favorecido la transmisión y diversificación del virus, con su consecuente adaptación al nuevo huésped humano.

Virus del SIDA (color verde) ensamblándose a un linfocito. / Centers for Disease Control.

Virus del SIDA (color verde) ensamblándose a un linfocito. / Centers for Disease Control.

Conviene recordar que los virus causantes del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se denominan virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y tipo 2 (VIH-1 y VIH-2, respectivamente), y que ambos presentan una alta variabilidad genética. Los primeros (VIH-1) se clasifican en 4 grupos: M, N, O y P. Los de tipo 2 (VIH-2) se dividen en 8 grupos de los cuales sólo dos tienen relevancia epidémica. La gran mayoría de las infecciones por VIH a nivel mundial se deben a virus VIH-1 del grupo M, mientras que las infecciones por VIH-2 suponen un pequeño porcentaje, concentrándose en países de África occidental como Guinea-Bissau, Gambia, Senegal, Cabo Verde, Costa de Marfil, Mali, Mauritania, Sierra Leona o Nigeria.

Cuando en los años 80 del pasado siglo se identificó y secuenció por primera vez el VIH-1, se vio que tenía cierta similitud con el virus Visna que infecta a ovejas. Esto dio pie a teorías conspirativas que afirmaban que el VIH-1 había sido generado en un laboratorio del ejército de los EEUU, supuestamente para eliminar a la raza negra y a los homosexuales. En 1986 se aisló un segundo tipo de virus en humanos que también causaba SIDA, el VIH-2, genéticamente muy parecido al VIH-1. Poco después se comprobó que el VIH-2 tenía una similitud incluso mayor con un virus que causaba síntomas similares al SIDA en algunos macacos cautivos. Posteriormente se aislaron virus parecidos en otros primates africanos como chimpancés, gorilas, monos verdes o mangabeys, que colectivamente se denominaron virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV, por sus siglas en inglés). Para diferenciarlos entre sí, a estos virus de simio se les añade un sufijo distintivo de la especie en la cual se han aislado. Hoy en día la ciencia ha demostrado que el origen del HIV está en estos virus de simios, los SIVs.

Chimpancé

Según los estudios, el virus SIV que infecta a los chimpancés es el origen del tipo de VIH responsable del 95% de las infecciones en humanos. / Alain Houle (Harvard University) – BMC Ecology image competition.

Estudios científicos apuntan a que los virus VIH-1 de grupo M, responsables de más del 95% de las infecciones por VIH, y los de grupo N provienen de la transmisión a humanos del SIV que infecta chimpancés (SIVcpz). Mientras, los grupos P y O del VIH-1 provendrían de la transmisión de virus que infectan gorilas (SIVgor). El VIH-2, por su parte, tiene su origen en los virus que infectan mangabeys grises (SIVsmm) que habitan en África occidental. Cada uno de los 8 grupos de VIH-2 se habría originado a partir de 8 eventos independientes de transmisión de estos monos a los humanos.

La infección por VIH tiene por tanto su origen en una zoonosis, esto es, la transmisión de una infección de una especie a otra. Sin embargo, la transmisión de un virus (u otro patógeno) entre especies no es algo sencillo. Estadísticamente las zoonosis no son frecuentes. Existen diversas barreras de especie que normalmente impiden que esto ocurra. Estas barreras pueden ser factores que el virus necesita en algún momento de su ciclo para replicarse en las células del individuo infectado y que, al ser diferentes entre especies, impiden al virus su utilización. En otros casos existen factores que actúan de manera dominante impidiendo la replicación del virus en determinadas especies. Cuanto más próximas filogenéticamente estén las dos especies, más fácil será que el virus consiga su propósito e infecte a la segunda especie. En el caso del SIDA este salto fue posible debido a la proximidad genética entre los chimpancés y los humanos y la capacidad intrínseca del virus de mutar. Después los factores socioeconómicos y demográficos mencionados habrían favorecido su propagación.

 

* Beatriz Pacheco trabaja como investigadora en el Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” gracias a un contrato JAE-Doc cofinanciado por el Fondo Social Europeo. Su proyecto de investigación está financiado por el 7º Programa Marco de la UE a través de un Marie-Curie Creer Integration Grant (grant agreement number 332623).

Virus que se usan para curar

VirusPor Mar Gulis (CSIC)

Sida, gripe, algunas hepatitis… La mayoría de la gente sabe que los virus son la causa de un gran número de enfermedades. También es conocido que pueden ayudarnos a prevenir trastornos de salud a través de las vacunas, que utilizan virus atenuados o inactivados. Sin embargo, ahora los últimos avances en la investigación médica podrían hacer que comenzáramos a verlos como auténticos agentes terapéuticos capaces de curar enfermedades.

La razón de este cambio de percepción radicaría en el uso de los virus en la terapia génica. Esta incipiente rama de la medicina consiste en modificar la información genética de los pacientes para combatir trastornos que no tienen cura a través de métodos tradicionales, como la administración de fármacos o la cirugía. Si bien se trata de un campo todavía en desarrollo, ya se han aprobado más de 1.800 protocolos de ensayos clínicos para la utilización de terapias génicas en todo el mundo.

En su libro Terapia génica (CSIC-Catarata), los investigadores Blanca Laffon, Vanessa Valdiglesias y Eduardo Pásaro explican que este nuevo enfoque fue concebido para el tratamiento de enfermedades relacionadas con defectos genéticos. Entre las 4.000 que se conocen en la actualidad se encuentran algunos problemas de gran importancia para la salud pública, como varias formas de cáncer y buena parte de las enfermedades cardiovasculares y degenerativas. En estos casos la terapia génica se propone corregir el defecto genético introduciendo en el interior de células de interés (células diana) nuevos genes que permitan al organismo realizar correctamente funciones que se encuentran alteradas. Un ejemplo paradigmático de este tratamiento es el de los ‘niños burbuja’ aquejados de inmunodeficiencia combinada severa. Las diferentes técnicas ensayadas con estos pacientes consisten en introducir en algunas células el gen correcto encargado de producir la proteína adenosina deaminasa (ADA), cuya carencia da lugar a la inmunodeficiencia.

En la actualidad la terapia génica no se emplea solo en el tratamiento de enfermedades genéticas sino también en otro tipo de trastornos, como la mayoría de los cánceres o algunas infecciones. En estas situaciones de lo que se trata es de recurrir a la manipulación genética para dotar a las células de alguna propiedad que puede aprovecharse con fines terapéuticos. Por ejemplo, en pacientes portadores del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), causante del sida, se han introducido genes antivirales que evitan la reproducción del VIH cuando este infecta una célula.

¿Y qué tienen que ver los virus con todo esto? La explicación reside en que el material del que están hechos los genes, el ADN, no puede simplemente tragarse como una píldora ni inyectarse directamente en la sangre. El ADN desnudo (sin ninguna cubierta protectora) se deterioraría y además no podría reconocer o penetrar en las células a las cuáles está destinado. Este ADN desnudo necesita un transportador, o vector, para protegerlo y dirigirlo hacia las células correctas del organismo.

Hoy día los virus son los agentes más utilizados como vectores. Estos microorganismos infecciosos están constituidos por fragmentos de ADN o ARN contenidos en el interior de una cápsula de proteínas y, en algunos casos, rodeados de una envoltura formada por grasas y otras proteínas. No tienen metabolismo propio, por lo que han de introducirse en el interior de las células y utilizar su maquinaria para reproducirse, generando, por una parte, copias de su material genético y, por otra, sintetizando las proteínas necesarias para formar la cápsula. Cuando se han producido estos componentes y las nuevas partículas virales se han ensamblado, estas son liberadas de la célula hospedadora, lo que generalmente produce la muerte de esta.

Terapia génica

En la terapia génica, el gen terapéutico se introduce en un vector -un virus u otro agente- que facilita su transferencia al interior de la célula.

La terapia génica no utiliza virus ‘normales’ sino modificados genéticamente a los que se les extraen los genes que les confieren características dañinas –aquellos encargados de su reproducción, principalmente– y se les incorporan el gen o los genes deseados para el tratamiento. Estos virus infectan literalmente a los pacientes y penetran en el núcleo de las células, como un virus cualquiera. Sin embargo, una vez allí depositan un material genético que da lugar a la proteína necesaria para la terapia y no se reproducen.

Los vectores virales constituyen los sistemas más eficaces para transferir genes, ya que son capaces de infectar una elevada proporción de células diana. Sin embargo, hay que tener en cuenta que su uso entraña algunas dificultades y limitaciones. En primer lugar, deben considerarse cuestiones de seguridad, bien porque puede producirse una transferencia involuntaria del virus nativo (que no ha sido modificado), bien porque la introducción del genoma del virus en el de la célula hospedadora afecte a genes originales de esta impidiéndole realizar correctamente su función.

Otro punto clave es la reacción inmunitaria que el organismo puede poner en marcha. Como consecuencia, es posible que el sistema inmune elimine el material genético que se ha introducido provocando la muerte de las células modificadas por la transferencia, lo que impediría que la terapia surtiese efecto. Por último es preciso mencionar que la cantidad de material que los virus pueden transportar es limitada –hay genes que no caben en los virus– y que la producción de vectores virales en grandes cantidades es difícil y muy costosa.