En el experimento anterior hicimos una foto de la diversidad microbiana que nos rodea y que normalmente no vemos. En este caso vamos a echar un vistazo a cuáles son las necesidades nutricionales de esos microbios. A este segundo experimento lo hemos llamado:
BICHO QUE NO COME, MUERE
Los niños aprenden en el colegio que todos los seres vivos necesitamos una serie de nutrientes variados para seguir siendo seres vivos: proteínas, carbohidratos, lípidos, minerales, vitaminas y otros elementos en menor cantidad. Los microbios también son seres vivos, así que requieren alimento, y esto es lo que vamos a analizar.
En el caso anterior tomábamos muestras de diferentes hábitats domésticos y estandarizábamos el medio de cultivo, el LB, que proporciona los nutrientes generales necesarios para microbios generalistas sin requerimientos especiales. Ahora vamos a hacer justo lo contrario, estandarizar las muestras y sembrar esas poblaciones más o menos equivalentes en una variedad de medios diferentes para comprobar en cuáles de ellos los microbios son capaces de crecer, y así descubrir qué necesitan para vivir.
Probaremos cada medio con dos muestras muy diferentes, una corporal (nariz) y otra de ambiente exterior (estanque). Ya vimos en el experimento anterior que las dos contienen muchos microbios, y son entornos lo suficientemente distintos (incluso en su temperatura) como para aventurar que los resultados podrían variar entre ambos.
Dado que en este experimento nosotros vamos a fabricar los medios, es un poco más elaborado que el anterior. Pero con poco más de lo que tenemos habitualmente en casa podemos preparar una gran variedad de medios de cultivo diferentes. A todos ellos les añadiremos agar para poder crecer las bacterias en placas. El agar es una especie de gelatina extraída de las algas y compuesta por una mezcla de carbohidratos. Como ya expliqué, tiene como fin únicamente proporcionar un soporte sólido para que las colonias de microbios crezcan separadas y no se mezclen. Por lo demás, la imaginación es libre. En nuestro caso, elegimos los siguientes medios (detallaré la preparación y cantidades más abajo):
- Medio blanco: agar y agua. Aunque existen ciertas especies de microbios capaces de comerse el agar, no es algo frecuente, por lo que en un medio compuesto solamente por agar y agua no deberíamos obtener crecimiento de colonias.
- Medios pobres en nutrientes:
Medio mínimo 1: agar, agua, azúcar y sal. En microbiología se utilizan a veces los llamados medios mínimos, que contienen lo estrictamente necesario para permitir el crecimiento de algunos tipos de bacterias poco exigentes. Generalmente no contienen proteínas, y suelen incluir solamente una fuente de carbono, por ejemplo un azúcar, y sales. Este medio es realmente mínimo: azúcar de mesa (sacarosa) y sal común (cloruro sódico).
Medio mínimo 2: agar, agua, glucosa y cóctel de sales. Para este medio hemos rebuscado en el botiquín de casa con el fin de preparar una mezcla de compuestos que se parezca más a los medios mínimos utilizados en los laboratorios. Elegimos tres productos de farmacia: Sueroral Hiposódico en sobres de polvo (glucosa, cloruro sódico, cloruro potásico, citrato sódico), pastillas de antiácido Rennie (carbonato cálcico, carbonato de magnesio, sorbitol) y Solución Fisiológica Cinfa en viales monodosis (cloruro sódico, hidrogenofosfato sódico, dihidrogenofosfato sódico). Para llegar a un verdadero medio mínimo nos faltarían sulfato y amonio, es decir, una fuente de azufre y otra de nitrógeno, y posiblemente nos sobraría algún otro compuesto que lleven los fármacos y que podría afectar al crecimiento de los cultivos. Pero por eso es un experimento.
Medio LB¯: agar, agua, extracto de levadura y sal. El medio LB normal lleva sal (cloruro sódico), extracto de levadura y triptona. La triptona es una mezcla de trozos de proteínas, mientras que el extracto de levadura también contiene proteínas, además de azúcares, minerales y vitaminas. En este caso preparamos un LB casero sin triptona, solo con extracto de levadura y sal, al que llamamos LB¯ (LB menos). Es decir, es parecido al LB, pero con menos proteínas.
- Medios ricos en nutrientes:
Caldo: agar y caldo de carne. El caldo de carne contiene todos los nutrientes necesarios que un microbio normal en cultivo podría soñar.
Leche: agar y leche.
LB: como control positivo de crecimiento, usaremos placas comerciales con LB agar como las que empleamos en el experimento anterior.
- Medios especiales: aquí se trata de experimentar con todo lo que a uno le apetezca. Pueden ser zumos, bebidas, caldos o cualquier otra cosa líquida o sólida que se disuelva bien en agua. En nuestro caso:
Coca-Cola: agar y Coca-Cola.
Isotónico: agar y Aquarius de limón.
Chocolate: agar, agua, chocolate y sal.
Materiales:
- Placas petri vacías: las placas vacías son más fáciles de encontrar y más baratas que las ya preparadas con medio. Nosotros las compramos en Sunbox-online.com, en paquete de 20 placas a 0,13 euros cada una; total, 2,60 euros.
- Recipientes para preparar medios: nosotros usamos matraces Erlenmeyer, pero serviría cualquier tipo de cacharro de vidrio para microondas.
- Agar: dado que es un sustituto de la gelatina muy empleado por los vegetarianos, se encuentra fácilmente en cualquier supermercado. La marca Vahiné lo vende en cajas con cuatro sobrecitos de dos gramos.
- Ingredientes para los medios: todo de casa, el súper o la farmacia. En cuanto a la levadura, no sirve la llamada levadura química o baking powder, que no es levadura sino una mezcla que reacciona para crear burbujas. Tiene que ser extracto de levadura, también llamada levadura de panadería.
- Cucharillas largas o algo similar para remover.
- Olla exprés y rejilla elevada con patas: la utilizaremos como autoclave casero para esterilizar los medios.
- Bastoncillos de algodón: a diferencia del experimento anterior, en este caso no necesitamos bastoncillos estériles. Dado que vamos a ensayar el efecto de los nutrientes, no nos importa tanto que las muestras no sean puras, mientras sean más o menos equivalentes. Si vienen con propina de microbios en los bastoncillos, bienvenida sea. Así que sirven los de la farmacia.
- Suero fisiológico: para empapar los bastoncillos antes de tomar las muestras de la nariz.
Preparación de los medios:
Preparando la olla exprés para autoclavar los medios. Imagen de J. Y.
Es preferible preparar medios más o menos limpios para evitar que los microbios presentes en los distintos ingredientes puedan falsear los resultados, y para evitar que dentro de la masa de agar queden microbios que crecen sin aire y que puedan estropear los cultivos. Aunque con los métodos caseros no podemos conseguir una esterilidad total para todos los ingredientes, al menos vamos a autoclavar algunos de ellos.
El autoclave es una máquina que esteriliza por vapor a presión, como una olla exprés. El vapor de agua en estas condiciones puede calentarse hasta unos 120 ºC. En nuestro caso, autoclavaremos el LB¯, el medio blanco (una parte del cual emplearemos para preparar el medio mínimo 2) y una solución de agua, agar y sal que luego utilizaremos para preparar el medio mínimo 1 y el de chocolate. No añadimos azúcar porque se caramelizaría al autoclavar, y por este motivo no autoclavamos las bebidas dulces. El caldo de carne y la leche vienen esterilizados de fábrica.
Para todos los medios vamos a utilizar agua del grifo. El agua corriente lleva cloro para impedir la contaminación microbiana. Existe la opción de dejar el agua en reposo antes de utilizarla para evaporar el cloro, como se hace antes de rellenar los acuarios, pero en nuestro caso hemos comprobado que no es necesario: tal vez el cloro ralentice el crecimiento al principio, pero con varios días de incubación probablemente acabe desapareciendo.
Echamos dos sobrecitos de agar (4 gramos) en un poco de agua del grifo, removemos para diluir y luego lo vertemos en medio litro de agua del grifo. En el laboratorio suele emplearse el agar al 1,5%, es decir, 1,5 gramos en 100 mililitros de agua, lo que nos daría 7,5 gramos en medio litro, casi una caja entera de Vahiné. Para no gastar tanto agar, hemos comprobado que podemos tirar casi con la mitad, 0,8%, o dos sobrecitos en medio litro.
Calentamos la mezcla en el microondas hasta que hierva, pero con cuidado de que no rebose. Removemos y volvemos a calentar hasta que el agar se disuelva por completo. Si vemos que después ha perdido mucho volumen de agua, podemos volver a rellenar con el grifo hasta el medio litro.
Con el medio litro de agua y agar disuelto hacemos cinco alícuotas de 100 mililitros cada una, que pueden medirse con un vaso medidor de mayonesa. Cada una de estas alícuotas la tendremos en un recipiente de vidrio de microondas. A cada una de ellas le añadiremos:
Alícuota 1: nada. Será el medio blanco.
Alícuota 2: nada. La utilizaremos para el medio mínimo 2.
Alícuota 3: añadimos 1 gramo de sal. La utilizaremos para el medio mínimo 1.
Alícuota 4: añadimos 1 gramo de sal. La utilizaremos para el medio de chocolate.
Alícuota 5: añadimos 1 gramo de sal y 0,5 gramos de extracto de levadura. Será el LB¯.
En realidad podríamos autoclavar juntas las alícuotas 1-2 y 3-4, dado que son iguales, pero idealmente debemos intentar manipular los medios lo menos posible después del autoclavado. El autoclavarlas juntas o por separado dependerá de la logística casera de cada uno: número de recipientes que tengamos, tamaño de la olla… Hay que tener en cuenta que los recipientes deben caber en la olla cerrada. Para cada placa petri utilizaremos unos 20 0 25 mililitros de medio, así que vamos a preparar cantidades en exceso.
Otro factor que puede condicionarnos es el límite mínimo de masa que podemos pesar con una balanza casera de cocina, aunque no necesitamos ser muy estrictos con las cantidades. Lo mejor es no tratar de pesar dos gramos, sino poner sobre la balanza un cacharro que pese y añadir el ingrediente hasta que la balanza marque dos gramos más. Pero según el límite que nos imponga la balanza, deberemos hacer más cantidad de medio o confiar en una aproximación razonable. Por ejemplo, la levadura de panadería Royal viene en sobres de 5,5 gramos. Podemos utilizar medio sobrecito (a ojo) y preparar medio litro de medio, aunque nos sobrará la mayor parte.
Una vez preparados los recipientes que vamos a autoclavar, los tapamos con doble hoja de papel de aluminio. No deben quedar herméticos, para que el vapor pueda entrar y salir. A continuación, preparamos la olla. Añadimos agua en el fondo, como mínimo un par de dedos o tres, metemos la rejilla elevada y colocamos los recipientes sobre ella. Los recipientes deben quedar por encima del agua, o los medios no se esterilizarán bien. Cerramos bien la olla, encendemos el fuego o la vitro, y a esperar.
Los medios deben autoclavarse durante 20 minutos desde que empieza a salir el vapor. Terminado este tiempo, quitamos la olla del fuego y dejamos que el vapor vaya saliendo lentamente. Es preferible no abrir la olla hasta que todo el vapor haya escapado y la olla se haya enfriado, de modo que podamos tocarla sin quemarnos. Una vez abierta, y mientras los medios aún están calientes y líquidos, añadimos los ingredientes que faltan:
Alícuota 1: nada. Es el medio blanco.
Alícuota 2: añadimos un cuarto de pastilla Rennie bien machacada, medio vial de Solución Cinfa y la cuarta parte de un sobre de Sueroral. Removemos bien hasta disolver, con un cubierto previamente esterilizado con alcohol y secado. Ya tenemos el medio mínimo 2.
Alícuota 3: añadimos 0,5 gramos de azúcar. Removemos y ya tenemos el medio mínimo 1.
Alícuota 4: añadimos chocolate al gusto. Si es en barra, fundiremos al microondas.
Alícuota 5: nada. Es el medio LB¯.
Nos quedaría elaborar los medios de Coca-Cola, isotónico, caldo y leche. Para cada uno de ellos prepararemos la cantidad que queramos, a razón de un sobrecito de agar para un cuarto de litro. Dado que no autoclavaremos estos medios, es importante abrir los envases justo cuando vayamos a prepararlos. Medimos las cantidades, añadimos el agar en un poco de cada líquido, disolvemos, lo echamos a cada recipiente y calentamos al microondas hasta disolver.
Vertiendo un medio en una placa. Imagen de J. Y.
Antes de que los medios se enfríen, mientras aún están líquidos, los vertemos en las placas, sin llegar al borde. Tenemos nueve medios distintos, a dos placas cada uno (para sembrar muestras de nariz y estanque), son 18 placas. Si sumamos las dos de LB que tenemos ya compradas, hacen un total de 20 placas. Los medios sobrantes podemos guardarlos en la nevera, sellados con plástico de cocina, por si algo sale mal y hay que repetir.
Dejamos las placas tapadas hasta que los medios se enfríen y solidifiquen. La condensación que se forme en las tapas podremos quitarla con una servilleta de papel. Entonces tomamos las muestras con los bastoncillos de algodón (mojados en suero en el caso de la nariz) y las sembramos, diez de nariz y diez de estanque, como expliqué en el experimento anterior.
Ahora, a incubar las placas en el horno a 37 ºC, tal como conté en el experimento anterior. Y a esperar un par de días o tres.
De izquierda a derecha y de arriba abajo, placas de LB (nariz), leche (nariz), caldo (estanque) y caldo (nariz). Imagen de J. Y.
Nuestros resultados: como era de esperar, crecieron colonias en el LB de control y en los dos medios ricos caseros, caldo de carne y leche. En el LB no se aprecian diferencias entre nariz y estanque, pero en el caldo crecieron más colonias en la muestra de nariz. Es posible que los microbios de la nariz encuentren en el caldo de carne un medio más parecido a su hábitat natural.
Como también era previsible, en la Coca-Cola no creció absolutamente nada. Inicialmente tampoco en el medio isotónico de Aquarius, aunque con el paso de los días empezaron a aparecer mohos en la placa de nariz. Tampoco creció nada apreciable en el chocolate. Hay un factor que no hemos controlado, y es la acidez (pH). La Coca-Cola es muy ácida, y esto afecta al crecimiento microbiano. Además de la acidez, estos medios pueden llevar ingredientes destinados a controlar el crecimiento de microbios.
Muestras de estanque (arriba) y nariz (abajo) en placas de medio mínimo 2 (izquierda) y blanco (derecha). Imagen de J. Y.
El resto de medios dieron resultados más curiosos. Para empezar, y ante nuestra sorpresa, crecieron algunas colonias en el medio blanco, solo con agar y agua; incluso más que en el medio mínimo 1, con azúcar y sal. Hay bacterias capaces de comerse el agar, pero son más bien raras y al devorar la superficie del medio crecen formando huecos, que no es nuestro caso. Lo cierto es que el medio agua-agar se utiliza para cultivar ciertos hongos, e incluso algunas bacterias pueden crecer lentamente en él. No sabemos qué es lo que nos ha crecido, pero es interesante que algunos microbios puedan vivir con tan pocos recursos. Otra posibilidad es que en el medio se nos hayan colado trazas de nutrientes con los que no contábamos. Estamos utilizando agar de cocina, no de laboratorio, y hemos podido observar que crecen más colonias con mayor proporción de agar.
Otro resultado sorprendente fue el del medio mínimo 2, el del cóctel de sales. En este caso crecieron bastantes colonias en la muestra de nariz, mientras que la placa del estanque se mantuvo limpia. O bien a los microbios del estanque les faltó algún nutriente, o su crecimiento quedó inhibido por alguno de los ingredientes de los productos que hemos utilizado. En cuanto a nuestro LB¯, funcionó peor de lo esperado; crecieron algunas colonias, pero pocas. Es cierto que al medio le faltaban proteínas y tal vez deberíamos haberle añadido una fuente adicional, como por ejemplo clara de huevo, pero esto no basta para explicar por qué crecieron menos colonias que en otros medios teóricamente más pobres en variedad de nutrientes.
En resumen, hemos visto que crecen más microbios cuando tienen una variedad de nutrientes más completa en su medio, pero también que hay otros factores que pueden influir, como la acidez y quizá algunos ingredientes antimicrobianos. Además, hemos descubierto que los requerimientos de los microbios de la nariz y del estanque son diferentes.
Nota: para descartar las placas una vez terminados los experimentos, preparen un cubo con lejía al 10% en agua y echen las placas dentro, abiertas. Déjenlas allí al menos media hora. Después viertan la lejía por el váter y tiren las placas a la basura normal.
